وتعد طريقة القطع بأنزيم واحد فى كلا من البلازميد والجين طريقة جيدة الا انها غير مناسبة دائما .
لكن هناك نوع اخر من الانزيمات يقطع الحمض النووى ويترك نهايات غير لاصقة او نهايات تامة او حادة او بشكل رأسي مستقيم blunt ..
مثل هدا الانزيم Alu I
|
5'… A G C T … 3'
3'… T C G A … 5'
|
وهدا النوع من القطع غير نشط للربط مباشرة . ولكن يتميز بأنه يمكن
ان اقطع البلازميد بانزيم معين بينما أقطع الجين بأنزيم اخر لان كلا منهما
لا ينتج نهاية لاصقة .
ولكن يعيب تلك الطريقة انه لايمكن استرجاع الجين بعد أن يتم الربط لانه بدلك تم تغير منطقة التعرف الخاصة بكل انزيم مثال البلازميد له التتابع A A T T l
|
5'… T T A A … 3'
3'… A A T T … 5'
|
Vector الناقل
بعد القطع :
5'… T T A A … 3'
3'… A A T T … 5'
Vector الناقل
5'… C T …G A A T… A G … 3'
3'… G A …C T T A… T C … 5'
بعد القطع Insert الجين
____
يكون الناتج :
5'… T T C T …G A A T… A G A A … 3'
3'… A A C T …C T T A… T C T T … 5'
Vector الناقل + Insert الجين
يلاحظ اختلاف تتابع تسلسل القواعد المزدوجة عن البداية .. و هنا لن يمكنا استرجاع الجين بنفس الانزيم الدى قطعنا به فى البدابة . ولذلك ينبغى الحذر والتخطيط الجيد واختيار الانزيمات المناسبة قبل بدأ عملية الكلونة .