تصنيف المثبتات:
لقد صنف بيكر المثبتات الي مثبتات كيماوية مخثرة للبروتين ومثبتات كيماوية غير مخثرة للبروتين. ومع انتاج مثبتات جديدة مهمة، وبسبب ازدياد معرفة خواص المثبتات الكيماوية الفيزيائية، هناك عدد من الأنظمة تستعمل حالياً لتصنيف المثبتات يعتمد بعضها على تركيب المثبت وبعضها على طبيعة عمل المثبت . تستعمل بعض المثبتا ت عند دراسه أنواع من الانسجه بحيث تسمح بفحص الأنسجه مجهرياََ مع المحافضه على العلاقات مابين خلا يا النسيج الواحد كما هي في حالتها الأصليه، فتسمى هذه الانواع من المثبتات مثبتات التشريح الدقيق، وهناك مثبتات تعمل بصورة متخصصة على أجزاء معينة من الخلية يطلق عليها عموماً اصطلاح مثبتات خلوية . ومن هذه المثبتات الخلوية أنواع أخرى تعمل على سيتوبلازم الخلية فتسمى مثبتات سيتوبلازمية وأنواع أخرى تعمل على النواة فتسمى مثبتات نووية.
المحاليل المثبتة:
تصنف المحاليل المثبتة الي نوعين من حيث التركيب:
أ-محاليل التثبيت البسيطة Simple Fixatives Agents.
ب-محاليل التثبيت المركبة Complex Fixatives Agents.
محاليل التثبيت البسيطة
1-مثبتات الفورمالين Formalin fixatives
هو غاز متطاير، ينتج عن أكسدة الكحول المثيلي لا لون له على درجة الحرارة العادية له رائحة مميزة سريع الذوبان في الماء كما يذوب في الكحول والايثر.
محاسنه:
1-يثبت البروتينات والشحوم المعقدة.
2-متوسط النفاذية للأنسجة.
3-سهل تحضيره.
4-رخيص الثمن.
مساوئه:
1-لايثبت الكربوهيدرات.
2-يرسب الاصباغ داخل الانسجة الغنية بالدم، ويمكن معالجتها بوضع الانسجة في محلول مكون من1% هيدروكسيد البوتاسيوم مع كحول 80% لمدة نصف ساعة.
3-يمكن أن يكون راسب أبيض يمكن تصفيته بالترشيح.
4-يسبب بخاره تأثير على العين والجهاز التنفسي.
2-حامض الخليك الثلجي Glacial Acetic Acid
محلول عديم اللون ذو رائحة مميزة يسبب انتفاخ في مكونات النواة ولذا لا يستعمل لوحده بل يضاف مستحضر له خاصية الانكماش مثل املاح الزئبق والكحول.
محاسنه
1-سريع النفاذ
2-يحفظ النويات كما في حالة الحياة
3-يستعمل لدراسة التراكيب النووية
مساوئه
1-لا يساعد في عملية الصبغ
2-لا يثبت الدهون والنشويات
3-يبقي الانسجة لينة
4-يحطم الميتو كندوريا واجسام جولجي
3-الكحول الايثيلي كمثبت
سائل عديم اللون يدخل أحياناً في بعض المثبتات المركبة ويستخدم بتركيز 70 – 100%.
حسناته
1-سريع النفاذ
2-يثبت البروتينات ولا يؤثر على الدهون
3-سهل الحصول عليه
سيئاته
1-يقسي الأنسجة
2-انكماش الأنسجة
3-يذيب النشويات ولايثبتها
4-كلوريد الزئبق Mercuric Chloride
من أهم الاملاح المستخدمة في تثبيت الانسجة.
محاسنه
1-سريع النفاذ
2-لايتلف الدهون والكربوهيدرات
3-يسهل عملية الصبغ
سيئاته
1-يسبب انكماش الخلايا
2-يرسب البروتينات على شكل بلورات ويتم التخلص منها بيوديد البوتاسيوم قبل الصبغ
5-حامض البكريك Picric Acid
يستعمل بتركيز 9, - 1,2%
محاسنه
1-سريع النفاذ
2-سريع التثبيت
3-يسهل عملية الصبغ
مساوئه
1-يسبب انكماش للخلايا
2-يرسب البروتينات
3-يتطلب مكان رطب لتخزينه بسبب قابليتة للانفجار
6-ثنائي كرومات البوتاسيوم Potassium Dichromate
محاسنه
1-يثبت السيتوبلازم دون ترسيبه
2-مفيد في تثبيت الشحوم
3-يثبت الميتوكندوريا
مساوئه
1-يتأكسد مع الكحول
2-لا يساعد في عملية الصبغ
7-حامض الكروميك Chromic Acid
يخزن على صورة محلول تركيزه 2%، ويعتبر من العوامل القوية لنرسيب البروتينات وكما انه يحفظ الكربوهيدرات ومن الضروري غسل الانسجة المثبتة به بالماء لمنع تكوين رواسب غير ذائبة.
8-حامض الخليك ثلاثي الكلوريد Trichlor Acetic Acid
يدخل في تركيب بعض المثبتات المركبة ويعتبر من عوامل الترسيب العامة للبروتينات وان كان يؤدي الي الانتفاخ في عديد من الانسجة
9-رابع اكسيد الاوزميوم Osmium Tetraoxide
مسحوق أصفر باهت يذوب في الماء معطياً محلول يعتبر من عوامل التأكسد القوية، سريع التطاير، يختزل بسرعة عند اتصاله بأي مادة عضوية أو تعرضه لضوء النهار، ولذلك يحفظ في زجاجات معتمة، وبخاره يؤدي الي العمى في العين.
وهذا المثبت غالي الثمن ويستخدم في مجالات عديدة لأنه المادة الوحيدة التي تثبت الدهون وتجعلها غير قابلة للذوبان في الكحول، وهو مثبت تقليدي في التحضيرات المجهرية الألكترونية بطء النفاذ للأنسجة.
محاليل التثبيت المركبه
وتنقسم هذه المثبتات الي:
أ-مثبتات التشريح الدقيق.
ب-مثبتات خلوية وتقسم الي: 1-مثبتات نووية
2-مثبتات سيتوبلازمية
مثبتات التشريح الدقيق Microanatomical Fixtives
1-الفورمالين الملحي 10% 10% Formol Saline
مدة التثبيت 24 ساعة، ويحضر كما يلي:
100مللتر فورمالين مركز 37-40%
9غم NaCL
900مللتر ماء مقطر
حسناته
1-يثبت جميع أنواع الانسجة
2-يحدث انكماش بسيط او قليل
3-لايسبب صلابة متزايدة للانسجة
4-يثبت الشبكة الكروماتينية
5-لا يتعارض مع استخدام الاصباغ
سيئاته
1-بطئ اللتثبيت والنفاذية
2-بخاره يؤذي العين والاغشية المخاطية
3-يسبب التهان للجلد
4-له رائحة حادة وكريهة
5-يظهر اصبغة في الانسجة المحتوية على دم بكميات كبيرة
2-الفورمالين الملطف Buffered Neutral Formaline Saline
مدة التثبيت 24ساعة أو أكثر، ويحضر كالتالي:
100مللتر فورمالين مركز 40%
900مللتر ماء مقطر
4غم فوسفات صوديوم الاحادية
6,5غم فوسفات الصوديوم الثنائي اللامائي
حسناته
مثل الفورمالين الملحي مضافاً أنه يمنع تكوين مواد راسبة في الانسجة.
سيئاته
مثل الفورمالين الملحي ولكن يحتاج الي وقت طويل لتحضيره.
3-محلول بوين Bouin,s Solution
مدة التثبيت من12-24ساعة، ويجب عدم غسل الانسجة بالماء بل تنقل فوراً الي الكحول70%، ويحضر كما يلي:
محلول البكريك المائي المشبع750مللتر
250مللتر فورمالين مركز40%
50مللتر حمض الخليك
حسناته
1-يستعمل لتثبيت الأجنة
2-يسبب تلف بسيط في الانسجة والنواة
3-يسهل عملية الصبغ
سيئاته
1-بطئ النفاذية
2-يسبب تلف شديد في تثبيت أنسجة الكلية
3-يسبب تحلل كامل او جزئي لكريات الدم الحمراء
4-محلول زنكر Zenker,s Solution
يستخدم لتثبيت أنسجة الغدة النخامية ونخاع العظم، وتتراوح مدة التثبيت من 4-18 ساعة ويغسل النسيج المثبت بهذا المحلول بالماء الجاري لمدة 8-12ساعة، ويحضر كما يلي:
100مل ماء مقطر
5غم كلوريد الزئبق
2,5غم ثنائي كرومات البوتاسيوم
1غم سلفات الصوديوم
5مل حامض الخليك الثلجي
حسناته
1-يثبت الانوية
2-يسهل عملية الصبغ
3-يقلل من الزمن اللازم في عملية صبغ الايوزين
سيئاته
1-غير ثابت
2-يحتاج النسيج المثبت لمدة أطول في الهيماتوكسلين بينما يقل زمن الايوسين
3-يكون راسب على شكل ابر يزال بمحلول اليود المشبع في كحول ايثيلي تركيزه 50%.
5-محلول جلوتر الدهايد Gluteraldehyde
مدة التثبيت من1-3 ساعات يحضر كما يلي:
25مل فورمالين 40%
50مل كلوريد الزئبق المشبع
75مل ماء مقطر
حسناته
1-يثبت البروتين جيداً
2-يثبت الشبكة الاندوبلازمية والخيوط المغزلية في الخلية
3-يجعل الانسجة صلبة
4-يستعمل للمجهر الالكتروني
سيئاته
1-يسبب انكماش بسيط
2-غير ثابت
المثبتات الخلوية :
1-المثبتات النووية
1-محلول فيلمنج Flemming Fluid
مدة التثبيت ما بين 24-48 ساعة، ويتركب من:
15مل حمض الكروميك
4مل رباعي اكسيد الازميوم المائي 2%
1مل حمض الخليك الثلجي
حسناته
1-اظهار مراحل الانقسام الخلوي
2-يحفظ الدهون بصورة دائمة
سيئاته
1-ضعيف النفاذية
2-يجب غسل الانسجة المثبتة بالماء لا تقل عن 24ساعة
3-تخلط مكوناته قبل استعماله مباشرة
2- محلول كارنوي Carnoy,s Fluid
تتراوح مدة التثبيت بين 3-6 ساعات، ويغسل المثبت بكحول ايثيلي مطلق مدة ساعتين او ثلاث ساعات لأزالة الكلورفورم، ويتركب من الاتي:
60مل كحول مطلق 100%
30مل كلورفورم
10مل حمض الخليك الثلجي
حسناته
1-جيد لتثبت النواة والجلايكوجين
2-يثبت اجسام نسيل في الخلايا العصبية
3-ثابت لفترة طويلة
سيئاته
1-يسبب انكماش كبير في الانسجة
2-المثبتات السيتوبلازمية
1-محلول فيلمنج بدون حامض الخليك
يستخدم في تثبيت الميتوكندوريا ومدة التثبيت ما بين24-48 ساعة، أما حسنات وسيئات هذا المحلول هي نفس حسنات وسيئات محلول فيلمينج، ولكن عدم وجود حامض الخليك يزيد من ايضاح أجزاء السيتوبلازم.
2-فورمل الملحي
يثبت باستعمال محلول الفورمالين الملحي ثم تغمر الانسجة في محلول 3%دايكرومات البوتاسيوم لمدة تتراوح بين 3-7 أيام
حسناته
صابغ جيد للسيتوبلازم ومحتوياته خاصة الميتوكندوريا.
