دورة البيوانفورماتك :: الدرس الثالث

[bioComputer]

بسم الله الرحمن الرحيم

الدرس الثالث

تقنيات الهندسة الوارثية

الهندسة الوراثية ( Genetic Engineering ) :


هي علم يهتم بدراسة التكوين الوراثي والتركيب الجينى للكائنات الحية ، من نبات وحيوان وإنسان ، ويستهدف معرفة القوانين التي تتحكم بالصفات الوراثية من أجل التدخل فيها تدخلاً إيجابياً ، وتعديلها أو إصلاح العيوب التي تطرأ عليها ، وقـد تمكن العلمـاء في السنوات الأخيرة من معرفـة الكثير مـن أسـرار الشيفرة الوراثية ( Genetic Code ) لبعض الحيوانات والنباتات والإنسان وأصبحوا قادرين بفضل الله تعالى على فعلِ شيءٍ من التَّغيير في الصِّفات الوراثيَّة للمخلوق ، كما تمكنوا من إنتاج أعضاء حية بالاعتماد على تقنية الهندسة الوراثية وعلم الجنين .

 وقد تمكن العلماء مؤخراً باستخدام طريقـة الاستنساخ ( Cloning ) من إنتـاج نُسَخٍ ( Copies ) من المخلوقات الحية انطلاقاً من خلايا غير جنسيَّة أخذوها من المخلوق الأصل ، ويأمل العلماء من تقنية الهندسة الوراثية أن تحلَّ لهم الكثير من المشكلات الطبية الراهنـة التي لا يمكن حلُّها بغير هذه التقنيـة .

 ومن أمثلة هده التطبيقات إنتاج أعضاء بديلة ( Substitute Organs ) لاستخدامها في زراعة الأعضـاء ( Organ Transplantation ) بدلاً من الأعضاء التالفة أو المريضة ، وذلك بأن يُنتج العضوُ المطلوبُ عن طريق خلية تؤخذ من جسم المريض نفسه ثم تزرع في مزارع خاصة أو في جسم أحد الحيوانات ، ثم يتم تحفيزها على التكاثر من أجل تشكيل العضو الجديد ، وبعد ذلك يُنزع العضو ويُزرع في جسم المريض ، وهي طريقة أفضل من الطريقة المتبعة اليوم التي يُؤخذ فيها العضوُ من أحد الأشخاص المتبرعين ويُزرع في آخر ، لأنَّ هذه الطريقة الأخيرة تسبب ظاهرة الرفض ( Rejection ) للعضو المزروع وتنتهي بفشل عملية الزراعة في كثير من الحالات .

كما يأمل العلماء مستقبلاً أنْ يسخِّروا الهندسة الوراثية في الوقاية من الأمراض الوراثية ، ومعالجة الكثير من التشوهات الخَلْقيَّة التي تشكل عبئاً اجتماعياً ونفسياً ومالياً ثقيلاً على المجتمع !

[bioComputer]

الإسـتنـسـاخ  Cloning

ماهى الكلونة او الإستنساخ (Cloning)؟


كلمة نسخة (Clone ) هي مجموعة من الخلايا أو المخلوقات الحية المتطابقة جنياً (أي أن مادتها الوراثية متطابقة) نتجت من خلية واحدة أو مخلوق واحد عن طريق التكاثر اللاجنسي. ومن هذا يمكن تعريف الإستنساخ بأنه عملية إنتاج نسخ مطابقة وراثياً للخلية أو المخلوق الأصلي. وفي مجال لتقنية البيولوجية (Biotechnology)، يستعمل هذا المصطلح ليدل على عدة عمليات يقوم بها البيولوجيون في المعمل منها إستنساخ الجنيات وهنا يتم أخد جين ( Gene) معين في صورة نقية ويتم عمل نسخ منه بكميات كبيرة،
وايضاً إستنساخ الخلايا حيث يتم إنتاج خلايا كثيرة مطابقة للخلية الأصلية. وأخيراً إستنساخ المخلوق الكامل، وفي هذه الحالة يتم إنتاج نسخ مطابقة للمخلوق الأصلي.

والخلاصة هي أن الإستنساخ هو مضاعفة عدد الجنيات أو الخلايا أو المخلوقات الحية من خلية أصلية واحدة.
 وفي مجال التقنية البيولوجية (Biotechnology) يتم منذ حوالي أكثر من عشرين سنة إستخدام تقنية إستنساخ الجينات والخلايا. هذه التقنيات استخدمت لإنتاج الأدوية واللقاحات لعلاج الأمراض مثل أمراض القلب والكلية وأمراض السكري والسرطانات المختلفة والتهاب الكبد المعدية وغيرها. كذلك هناك أبحاث جارية لإستنساخ أعضاء الجسم الإنساني وأنسجته كما أسلفنا سابقاً.

إن أهم ما يهتم به العلماء في باب الاستنساخ هو نسخ قطع من الدنا ( الدي إن أي DNA ) سواء كانت هذه القطع عبارة عن جين(مورث)أو جميع الجينوم(أي كل الدي إن أي الموجود في الكائن الحي).
و يحتاج العلماء للقيام بنسخ القطع الجنية لأنهم يحتاجون إلى كمية كبيرة من هذه النسخ و ذلك لندرة استخلاصها في كل مرة من داخل الخلية و ذلك لوجود التعقيدات الإنشائية للكروموسومات .
و على سبيل المثال فان الجين المنتج لسلسة بيتا في الهيموجلوبين و المعروف بمورث  ببيتا جلوبين( Beta-Globin Gene) يمثل فقط 0.00005% من حجم الدنا DNA الكلي في الخلية(و الذي يتراوح ب 3بلايين قاعدة نووية).كما أن الجين العملاق و المعروف بجين الدستروفين( Dystrophin Gene ) و الذي يتراوح حجمه بال2.5 ميجابيز (2.5Megabases ) لا يمثل أكثر من 0.08% من الحجم الكلي للدي إن أي في الخلية.و لذلك فان العلماء يحتاجون إلى إجراء نسخ لهذه الجينات أو القطعة من الدنا ( الدي إن أي DNA ) لكي يتسنى لهم التعامل بها و إجراء التجارب عليها.

[bioComputer]

طرق نسخ الجين :



1- قص الجين المطلوب بواسطة انزيمات التحديد Restriction enzyme

2- ربط او لصق الجين فى البلازميد plasmid بواسطة انزيمات البلمرة. لوضعه فى الخلية البكترية بعد دلك ليتضاعف ..

3- ننقل البلازميد الى الخلية البكترية .
 حيث يعمل البلازميد كناقل او حامل (Vector) للجين ليدخل فى الخلية البكترتية ودورة حياتها ليتضاعف الجين عندما تنقسم الخلية البكتيرية، حيث تنتقل نسخ من الناقل المحتوي على الجين إلى الخلايا البكتيرية الجديدة ويتضاعف الجين من جديد.

4- بعد أن تتكاثر الخلية البكتيرية عدة مرات، يتم إختيار المستعمرة المحتوية على الجين المطلوب بواسطةعملية تسمى التنقية او الغربلة(Screening ).

5- عزل الجين بعد تكبيره وعمل نسخ منه كثيرة .
وبهذا نكون قد حصلنا على نسخة نقية من الجين المطلوب
الان سنتعرف على هده الخطوات بالتفصيل .

[bioComputer]

Enzymesالانزيمات  

عرفنا مسبقاً ان الجين هو عبارة قطعة صغيرة من الكرموسوم  او الجينات ... فكيف يمكن الحصول على الجين منها ؟؟؟!!
لاشك ان فى ذلك قصة مثيرة سنعرفها معاً .. فالحصول على الجين بصورة نقية هو السؤال الدى حير العلماء كثيراً ولم يكن يعرفوا له اجابة حتى عام 1970.
من المعروف لدى علماء الميكروبيولوجيا أنه اذا وضع مستخلص الدنا extract of DNA فى وسط مغذى به بكتريا فانها تستهلك الدنا وتنقله داخل الخلية.. ولكن لوحظ عند دخول الجين الى الخلية البكترية فانه لا يستطيع التعبير عن نفسه ...ولوحظ ايضاً ان بعض البكتريا يمكنها التغلب على الفيروسات التى تهاجمها وتحقن فيها الحمض النووى الفيروسى الخاص بالفيروس نفسه ، حيث تعمل البكتريا على تكسير هذا الجين والحمض النووى الغريب الخاص بالفيروسات بواسطة جهازها المناعى البسيط . الذى يعرف بنظام التحديد او القطع المحدد والتعديل او التحوير Bacterial Restriction/Modification system.

[bioComputer]

حيث تستخدم الخلية البكرتية الى نوعين من الانزيمات لحماية نفسها



1- انزيمات التحديد  Restriction enzymes :
 حيث تقوم بتحديد اماكن معينة فى تتابع الدنا الغريب وقصه وتقطيعه الى اجزاء صغيرة لا يوجد اى ضرر منها

Modifying enzymesانزيمات التعديل او التحوير -2
وهى التى تستخدم فى تحوير الدنا الخاص بالبكتريا نفسها  وتغير من شكله حتى تميز بينه وبين الدنا الغريب .

حيث تقوم باضافة مجموعة مثيلMethyl ( CH3 ) الى الاحماض النووية الخاصة بها عن طريق انزيم المسيليز Methylases فى عملية تسمى ( دام وديسم مثيليشين dam and dcm methylation ) .
حيث تفوم البكتريا باضافة مجموعة مثيل Methyl الى قاعدة الادنينA  والسيوتسين C
(Methylation at an A or a C residue ) الموجودة فى الدنا البكتيرى .
وبالتالى لا تستطيع انزيمات التحديد من الاقتراب من الدنا البكتيرى لانه محمى ومغطى بمجموعات المثيل .
وبالتالى عندما يدخل اى حمض نووى غريب الى الخلية البكترية تقوم انزيمات القطع المحدد بتقطيعه ادا لم يكن محمى بوجود مجموعة المثيل على قواعده .

ولكن تلك مشكلة هامة تقابلنا عندما وضع الجين الغريب الدى نريد نسخه ووضعنه داخل البكتريا .. حيث ستقوم أنزيمات البكتريا على الفور بتقطيع الجين وتدميره ،لدلك يجب علينا عند استخدام اى خلية بكترية فى النسخ ان نقوم بابطال نظام المثيل حتى لا تقوم بتقطيع الجين المراد نسخه .

[bioComputer]

الانزيمات :

الانزيمات ما هى فى الاصل الا بروتينات تعمل كحفاز او كعامل مساعد فى التفاعلات الحيوية تزيد من سرعة التفاعلات ولكن لا تغير من طبيعتها . الانزيمات التى يتم استخدامها فى معالجة شريط الدنا عبارة عن مجموعات عديدة هى :

Restriction enzyme انزيمات التحديد
Polymerases  أنزيمات البلمرة
Nucleases الانزيمات النووية  
    modifying enzymesانزيمات التعديل  
Ligases enaymes انزيمات الربط

[bioComputer]

انزيمات القطع المحدد  Restriction enzyme
وهى الانزيمات التى تستخدم كأداة من أدوات البيوتكنولوجى حيث تقوم بقطع الدنا فى مكان محدد
وتسلسل معين يعرف باسم موقع القطع Restriction site أو موقع التعرف Recognition Sequence ،
ويتم القطع بها على أمل ان الجين المراد دارسته يقع بجواره . ويتم معرفة دلك بالعديد من الابحاث والدارسات والكثير من التجارب المعملية .


خصائص انزيمات القطع المحدد  : Characteristics of Restriction enzyme
1- غالباً يتم عزلها من اتواع البكتريا المختلفة او فطر الخميرة .
2-  يقطع الحمض النووى فى نقطة محددة اومكان وموقع قطع معين    Recognition Sequence    
3- تعمل كنظام مناعى مصغر للبكتريا يحميها من جزئيات الدنا الغريب مثل الاصابة الفيروسية .
4- انزيمات القطع اما تترك نهايات لاصقة او بشكل متعرج cohesive or sticky  مثل الإنزيم القاطع إيكو أر واحد (Eco RI ) يقطع عندما يجد 6 من الأحماض النووية في هذا التسلسل( GAATTC).



او نهايات تامة او حادة او بشكل رأسي مستقيمblunt  مثل الإنزيم القاطع هبا1 (Hpa 1 ) يقطع عندما يجد 6 من الأحماض النووية في هذا التسلسل( GTTAAC).










5- مناطق القطع غالباً تكون متقابلة palindromic DNA sequences  ( اى توجد منطقة القطع بنفس التتابع
على شريطى الدنا العلوى والسفلى عكس بعض ) ومكونة من 4-8 زوج من القواعد 4-8 bp
مثل الإنزيم القاطع إيكو أر واحد (Eco RI )  .

[bioComputer]

6- احتمالية القطع نظرياً عدد القواعد الناتجة عند استخدام انزيم معين تنتج من القانون P=(1/4) n
حيث P تعنى عدد القواعد المحتمل ظهورها Cutting Probability
و 4 تمثل عدد حروف اللغة الجينية وهى قواعد النتروجين الاربعة
و n تمثل عدد القواعد المعينة الخاصة بكل انزيم التى يتعرف عليها ويقطع عندها الجين .
مثال :
فى جزئ الدنا المكون من الف قاعدة مزدوجة .. ما عدد مرات القطع  فيه ادا استخدمنا انزيم إيكو أر واحد (Eco RI ) الدى منطقة القطع الخاصة Recognition Sequence    به مكونة من 6 قواعد ..؟؟؟
الحل '>1/4)^6=1/4096  p =
ادن عدد مرات القطع =  /4996  1000  = مرتان
والقطع الناتجة = قطعتان

ملحوظة هامة :
عدد القطع يختلف ادا كان الجين دائرى عما ادا كان عبارة عن شريط مستقيم
ادا كان الشريط دائرى فان عدد القطع يساوى نفس العدد الناتج من القانون
اما ادا كان الشريط مستقيم فاننا نزيد واحد نتيجة تبقى طرف كما هو بالرس

[bioComputer]

أنزيمات البلمرة Polymerases  

تقوم بتكوين نسخ من الأحماض النووية عن طريق ربط النيوكليوتيدات بالقواعد المكملة للشريط الدنا     DNAtemplateالمنسوخ الدى يعمل كقالب للنسخ
 .. وتعمل فى الاتجاه 5 الى 3 عن طريق اضافة النيوكليوتيدات الجديدة الى مجموعة الهيدروكسيل الحرة على الطرف 3 لتكون رابطة استر ثنائى الفوسفات .


انزيم الدى اى ان بوليمريز  1DNA polymerase
يقوم بعمل نسخ من الحمض النووى عن طريق لصق النيوكلوتيدات ببعهضا البعض .
 كل زوج من النيوكلتيدات يكون مكمل للاخر ويعمل فى الاتجاه  3الى 5 حيث يضيف النيوكلوتيدة الجديدة الى الطرف 3 الذى به مجموعة الهيدروكسيل الحرة .ويقوم باضافة شريط مفرد من الدى ان ابه  الى الشريط الاصلى المزدوج من الدى ان ايه ،،ويساعد فى عمل شريط جديد مفرد من الشريط الاصلى .


انزيم  Klenow
يستخدم لملء الفجوات فى النهايات اللزجة للناقل وليس للجين نفسه . او يعمل على عمل طفرة فى الجين عن طريق اضافة قليل من النيوكلوتيدات فى تتابع الجين.


انزيم النسخ العكسى Reverse transcriptase
انزيم النسخ العكسى يقوم بنسخ الدى ان ايه من شريط الار ان ايه .
تذكر ان الطبيعى هو ان يتم نسخ شريط الاران ايه من الدى ان ايه .. ولكن هذا الانزيم يقوم بعكس هذه العملية .

[bioComputer]

الانزيمات النووية : Nucleases

وهى التى تقوم بتكسير  الاحماض النووية عن طريق كسر الرابطة الفوسفاتية .
وتنقسم حسب مكان التأثير  والقطع الى :
•   خارجية القطع : حيث تقطع الاطراف  مثل :
انزيم الاكسونيوكليز 3 Exonuclease III  الذى يقطع النيوكليوتيدات من الطرف 3
و انزيم بال 31 Bal31  الذى يقطع النيوكليوتيدات من كلا الطرفين
•   داخلية القطع :حيث تقطع داخل شريط الدنا نفسه مثل :
انزيم اس1 اندنيوكليز S1 nuclease  ويقوم بقطع الشريط المفرد سواء كان دىان ايه او اران ايه
 وانزيم دى انيز1  DNaseI الذى يقطع شريط الدى ان ايه سواء كان شريط واحد ام شريطين فى مواقع مختلفة ، ويستخدم فى تنقية الار ان ايه من الدىان ايه فى عملية العزل واستخلاص الاران ايه من الخلية .

[bioComputer]

Modifying enzymesانزيمات التعديل والتحوير  

وهى التى تستخدم فى تحوير الدنا وتغير شكله سواء باضافة المثيل اليه او كسر الروابط بين القواعد او اضافة قواعد جديدة وهى تنقسم الى ثلاثة انواع :


1.   انزيم نزع الفوسفات Alkaline phosphatase:
ينزع مجموعة الفوسفات من النهاية 5 ليمنع اى التصاق غير مرغوب فيه فى طرف الجين .
فهو يستخدم لينزع المجموعة الفوسفات من الطرف 5 من الناقل حتى يمنع اعادة الالتفاف باتحاد طرفى الناقل بعد فتحه .

2.   انزيم اضافة الفوسفات Polynucleotidekinase:
يستخدم لاضافة مجموعة الفوسفات للطرف الحر 5 .وهو غالباً يستخدم لاضافة فوسفات معلم بالاشعاع ( تم تعريضه للاشعاع ) للناقل على الطرف 5 الذى به مجو عة الهيدروكسيل للحصول على ناقل معلم ومميز بالاشعاع حتى يسهل فحصه بعد ذلك .وايضاً يستخدم لنزع مجموعات من  فوسفات من الاطراف الناقل ليمنع عملية الربط الغير مرغوب فيه عن طريق الخطأ حيث يمنع عملية التفاف الناقل حول نفسه .

3.   Terminal deoxynucleotidyl transferase :
يستخدم لاضافة قاعدة واحدة او العديد من القواعد للطرف 3 . وهو يستخدم لاضافة ذيل من العديد

[bioComputer]

Modifying enzymesانزيمات التعديل والتحوير  

وهى التى تستخدم فى تحوير الدنا وتغير شكله سواء باضافة المثيل اليه او كسر الروابط بين القواعد او اضافة قواعد جديدة وهى تنقسم الى ثلاثة انواع :


1.   انزيم نزع الفوسفات Alkaline phosphatase:
ينزع مجموعة الفوسفات من النهاية 5 ليمنع اى التصاق غير مرغوب فيه فى طرف الجين .
فهو يستخدم لينزع المجموعة الفوسفات من الطرف 5 من الناقل حتى يمنع اعادة الالتفاف باتحاد طرفى الناقل بعد فتحه .

2.   انزيم اضافة الفوسفات Polynucleotidekinase:
يستخدم لاضافة مجموعة الفوسفات للطرف الحر 5 .وهو غالباً يستخدم لاضافة فوسفات معلم بالاشعاع ( تم تعريضه للاشعاع ) للناقل على الطرف 5 الذى به مجو عة الهيدروكسيل للحصول على ناقل معلم ومميز بالاشعاع حتى يسهل فحصه بعد ذلك .وايضاً يستخدم لنزع مجموعات من  فوسفات من الاطراف الناقل ليمنع عملية الربط الغير مرغوب فيه عن طريق الخطأ حيث يمنع عملية التفاف الناقل حول نفسه .

3.   Terminal deoxynucleotidyl transferase :
يستخدم لاضافة قاعدة واحدة او العديد من القواعد للطرف 3 . وهو يستخدم لاضافة ذيل من العديد من النيوكلتيدات .

[bioComputer]

انزيمات الربط Ligases :

يعيد ربط الروابط المكسورة والمنقطعة فى شريط الدنا .. ويستعمل فى ربط أجزاء الدنا الاتية من المصادر المختلفة مع بعض .

Ligases انزيم الليجيز  
انزيم خلوى يعمل على اعادة ربط روابط الفسوفو استير المكسورة عن طريق الربط بين اطراف الشريط .

[bioComputer]

أمثلة لتسلسل مواقع القطع  Recognition Sites لبعض الإنزيمات القاطعة Restriction enzyme





ملحوظة هامة جداً :
فى الجدول السابق الاختصارات التالية تدل على :

Py : تعنى قواعد بيرميدينية Pyrimidine و هم سيتوزين Cytosine و اليوراسيل Uracil و الثايمين Thymine
Pu : تعنى قواعد بيورينية Pruines وهم الأدينين Adenine و الجوانين Guanine
N  : تعنى اى نوع من القواعد بيورينية Pruines او بيرميدينية Pyrimidine


ملحوظة :
مواقع القطع غالباً تكون متقابلة palindromic DNA sequences  ( اى توجد منطقة القطع بنفس التتابع
على شريطى الدنا العلوى والسفلى ) ومكونة من 4-8 زوج من القواعد 4-8 bp
مثل انزيم الإنزيم القاطع إيكو أر واحد (Eco RI )  :  
5'… G | A A T T   C … 3'
3'… C   T T A A | G … 5'
ولكن هناك بعض مواقع القطع تكون  غير متقابلة Non-palindromic DNA sequences
مثل انزيم الإنزيم القاطع بى بى ام واحد  (Bpm I )  :  
5'… C T G G A G N16| … 3'
3'… G A C C T C N14| … 5'


تم بحمد الله الدرس الثالث '>

[ابو يوسف]

اللقاء الثالث في ملف pdf